引物设计原则(如果上下游引物Tm值相差较大该怎样设定反应)

上游引物就是和要扩增基因片断上游序列结合的引物（引物就是单链寡聚核苷酸，基因扩增需要从引物开始），同理，下游引物指与目的基因片断下游序列结合者。

如果差距过大可以重新设计

PCR引物又称为寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，PCR引物通常是一对，引物1和引物2。由于DNA聚合酶只能从核苷酸链的5'端到3'端进行复制，也就是只能识别3'的尾端，而且只能把核苷酸连到已经和DNA模板互补产生的多核苷酸链上，所以引物1和2分别于双链DNA的两条链的尾部(就是末尾是3'端的那一边)结合，为那些脱氧核苷酸提供3'的末端，就相当于开了个头。

然后在DNA聚合酶的作用下合成两条新链。而那段引物就成了新链的一部分。 其实在生物体内的DNA复制也是这样的一个过程，只是引物是人体自身合成的引物设计原则* 序列选取应在基因的保守区段* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构 * 典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

* Tm值在55-65℃(因为60℃核酸外切酶活性最高)，GC含量在40%-60%* 引物之间的TM相差避免超过2℃* 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基* 为避免的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

* Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp * 引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C